Risposta anticipate di Fibroblasti e Cellule Epiteliali all’impianto anodizzato di color rosa: Studio in Vitro

Federico Mussano, DDS, PhD1/Tullio Genova, PhD2/Marco Laurenti, PhD3/Elisa Zicola, MSc4/ Luca Munaron, PhD5/Paola Rivolo, PhD3/Pietro Mandracci, PhD6/Stefano Carossa, MD, DDS7

Obiettivo: questa ricerca mirava a valutare se le superfici anodizzate di colore rosa potessero migliorare l’adesione delle cellule dei tessuti molli rispetto alle superfici in titanio lavorate non trattate. Materiali e metodi: Sono stati preparati due tipi di campioni di titanio Ti-Al-V: titanio lavorato (Ti) e titanio anodizzato (AnoTi). La microstruttura è stata studiata per mezzo di un microscopio elettronico a scansione. Anche la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) è stata effettuata. Le proprietà bagnanti sono state studiate con la tecnica della goccia sessile con acqua e diiodometano. Per studiare la risposta biologica in vitro, sono state utilizzate la linea cellulare epiteliale HaCaT e la linea cellulare fibroblastica NHDF. Sono stati valutati l’adesione, la morfologia e la proliferazione cellulare. Risultati: la microstruttura delle superfici testate era irregolarmente liscia per entrambi i tipi di campioni senza differenze morfologiche rilevanti. L’XPS e l’HR-XPS eseguiti sui campioni AnoTi hanno confermato la presenza di Ti, O e C, insieme agli ossidi di Ti. Seguendo le misurazioni dell’angolo di contatto ottico, il processo di anodizzazione ha indotto una leggera transizione verso il regime idrofobo. Di conseguenza, i valori di energia libera dalla superficie differivano significativamente tra i campioni anodizzati e quelli lavorati. Ti anodizzato ha aumentato significativamente l’adesione e la proliferazione sia delle cellule epiteliali che dei fibroblasti rispetto ai controlli incontaminati di Ti. Conclusioni: Rispetto allo standard clinico, le superfici anodizzate potrebbero migliorare l’adesione dei due principali tipi di cellule all’interno dei tessuti molli peri-implantari, il che rende l’anodizzazione rosa un’opzione promettente per l’implantologia dentale. Int J Oral MaxIllOfac IMplants 2018;33:571–579. doi: 10.11607/jomi.6479

 

Parole Chiave: titanio anodizzato, fibroblasti, cheratinociti, energia superficiale, bagnabilità, spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS)

 

Gli impianti dentali rappresentano un’opzione fondamentale per curare l’edentulismo, parziale o completo.

1Assistant Professor, CIR Dental School, Department of Surgical Sciences, UNITO, Turin, Italy.

2Scientist, CIR Dental School, Department of Surgical Sciences, UNITO, Turin, Italy; Department of Life Sciences and Systems Biology, UNITO, Turin, Italy.

3Scientist, Politecnico di Torino, Department of Applied Science and Technology, Materials and Microsystems Laboratory (ChiLab), Torino, Italy.

4Scientist, Department of Clinical and Biological Sciences, UNITO, Orbassano (TO), Italy.

5Associate Professor, Department of Life Sciences and Systems Biology, UNITO, Turin, Italy.

6Associate Professor, Politecnico di Torino, Department of Applied Science and Technology, Materials and Microsystems Laboratory (ChiLab), Torino, Italy.

7Professor, CIR Dental School, Department of Surgical Sciences, UNITO, Turin, Italy.

 

I primi ed I secondi autori hanno contribuito in egual misura a questo studio.

 

Corrispondenza a: Dr Federico Mussano, CIR Dental School, Department of Surgical Sciences, UNITO, via Nizza 230, 10126 Turin, Italy.

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Dai primi studi di Brånemark, la ricerca si è focalizzata sull’interazione tra impianti ossei e titanio.1 Tuttavia, per essere utilizzati clinicamente, gli impianti devono essere collegati a una protesi intraorale, il che implica la presenza di una componente transmucosa che si interfaccia anche con fibroblasti e cellule epiteliali.2 Le risposte cliniche indesiderate ma frequenti come la recessione gengivale e la cosiddetta peri-implantite hanno recentemente evidenziato l’importanza del tessuto molle attorno all’impianto come possibile barriera alla penetrazione batterica lungo l’impianto.3,4

Sebbene la parte extraossea di un impianto possa essere progettata per ridurre l’accumulo di placca, restano diverse limitazioni per quanto riguarda l’altezza e la qualità del tessuto molle che circonda l’impianto. Infatti, il tessuto connettivo e l’epitelio si attaccano alla superficie della radice cefalea di un dente naturale, 5 ma agiscono in modo diverso attorno agli impianti.6,7 A tal fine, sono state recentemente proposte numerose modifiche superficiali.8-11 L’anodizzazione degli abutment implantari in titanio sono stati recentemente introdotti per scopi estetici con risultati soddisfacenti.12,13

Questo processo di passivazione elettrolitica viene utilizzato per aumentare lo spessore dell’ossido di titanio

Naturale in una gamma submicrometrica, ottenendo toni sfumati rosa o oro che possono ridurre lo sgradevole luccichio grigio che può risplendere attraverso la mucosa. Può valere la pena notare che si tratta di colori di interferenza; cioè, sono causati dall’interferenza tra le lunghezze d’onda della luce che si riflettono sul metallo sfuso e sulla superficie rivestita di ossido. Quindi, l’introduzione di qualsiasi pigmento esogeno è evitata. Sebbene l’anodizzazione sia già stata ampiamente utilizzata per migliorare l’osteointegrazione, 14,15 meno noto è il suo possibile ruolo nel guidare l’adesione selettiva dei due principali tipi di cellule all’interno della mucosa gengivale: cellule epiteliali e fibroblasti.

In questo studio, gli autori hanno cercato di valutare se le superfici anodizzate potessero migliorare l’adesione delle cellule dei tessuti molli rispetto alle superfici in titanio lavorate non trattate utilizzate clinicamente. Per assolvere a questo compito, è stata testata la risposta precoce delle cellule epiteliali umane e dei fibroblasti in termini di adesione cellulare, morfologia e vitalità.

 

MATERIALI E METODI

Preparazione del Campione

I campioni di titanio Ti-Al-V sono stati preparati e formati come cilindri 8 × 3 mm (2r × h) (Igimax). Sono stati ottenuti due tipi di campioni: titanio non trattato (Mac) e titanio anodizzato (AnoTi). I campioni sono stati puliti con acetone e sciacquati in una soluzione acquosa al 70% di isopropanolo; successivamente, sono stati decontaminati in un bagno a ultrasuoni per 5 minuti in isopropanolo e risciacquati in acqua Milli-Q. I campioni anodizzati sono stati ottenuti seguendo protocolli stabiliti. Per rimuovere lo strato di ossido di titanio naturale, i campioni di AnoTi sono stati prima immersi in una miscela di acido nitrico (HNO3) e acido fluoridrico (HF) a temperatura ambiente per 10 minuti; successivamente, sono stati lavati in acqua Milli-Q per 20 minuti. Per generare uno spesso strato di ossido di titanio, i campioni sono stati immersi in una cella galvanica contenente una soluzione di acido fosforico e fosfato trisodico a una data intensità di energia. Alla fine del processo, i campioni sono stati lavati in acqua Milli-Q per 20 minuti.

 

Microscopio

Scansione a microscopio ad elettroni. La microstruttura è stata studiata con un microscopio elettronico a scansione (Zeiss EVO 50, Carl Zeiss). Per evitare la contaminazione, i campioni sono stati lavati in acqua distillata, risciacquati accuratamente in etanolo al 70%, puliti a ultrasuoni per 20 minuti in etanolo assoluto e asciugati all’aria sotto una cappa a flusso laminare.

Spettroscopia a fotoelettroni a raggi X. La spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) è stata effettuata utilizzando un sistema PHI 5000 VersaProbe (Physical Electronics). La sorgente di raggi X era una radiazione monocromatica di Al Kα.

 

 

La scala energetica di legame è stata calibrata assegnando un valore energetico vincolante di 284,8 eV al contributo C1 principale.

I segnali XPS sono stati raccolti utilizzando uno spettrometro a raggi X SPECS (Phoibos MCD 150), con radiazione Mg Kα (1,253,6 eV) come sorgente di raggi X, con una potenza di 150 W (12 mA, 12,5 kV). La dimensione dello spot della regione analizzata era 7 × 20 mm. L’emissione di pho-elettroni dal campione è stata analizzata ad un angolo di decollo di 90 gradi in condizioni di ultra-alto vuoto (UHV). Nessuna compensazione di addebito è stata applicata durante l’acquisizione. Dopo la raccolta, le energie leganti sono state calibrate usando come riferimento il picco di carbonio C1s. La precisione delle energie di legame riportate (BE) può essere stimata in ± 0,1 eV. Le aree di picco dell’XPS sono state determinate dopo la sottrazione di uno sfondo. I calcoli del rapporto atomico sono stati eseguiti dopo la normalizzazione utilizzando il fattore di campo Sco di ciascun elemento. Tutte le elaborazioni dello spettro sono state eseguite utilizzando il software Casa XPS v2.3.13 (Casa Software) e Origin 7.1 (Origin Laboratory). La scomposizione spettrale è stata eseguita utilizzando le funzioni Gaussian-Lorentzian (70% / 30%) e l’intera larghezza a metà massimo (FWHM) è stata fi ssata per ciascun dato picco.

 

Coltura cellulare

Per caratterizzare la risposta biologica in vitro, sono state utilizzate la linea cellulare epiteliale HaCaT e la linea cellulare fibroblastica NHDF (ECACC). Le cellule sono state mantenute in Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco  integrato con siero bovino fetale al 10% (Tecnologie della vita), 100 U / mL di penicillina e 100 Ug / ml di streptomicina; sono stati fatti passare in subconfluenza per prevenire l’inibizione del contatto; e sono stati tenuti in atmosfera umida del 5% di CO2 nell’aria, a 37 ° C.

 

Adesione cellulare

L’adesione cellulare è stata valutata su campioni di titanio usando una piastra a 24 pozzetti (BD) come supporto. Le cellule sono state stacciate usando tripsina per 3 minuti, conteggiate con cura e seminate a 3 × 103 cellule / disco in 100 μL di terreno di crescita sui dischi con rugosità diversa. Le piastre da 24 pozzetti sono state mantenute a 37 ° C, 0,5% di CO2 per 10 minuti. Prima e dopo la fissazione in paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 15 minuti a temperatura ambiente, le cellule sono state lavate due volte con PBS e quindi colorate con 1 μM DAPI (Molecular Probes) per 15 minuti a 37 ° C per visualizzare nuclei cellulari. Le immagini sono state acquisite usando un microscopio Nikon Eclipse TE con un obiettivo 40 ×.17 I nuclei cellulari sono stati contati usando lo strumento “Analizza particelle” del software ImageJ (ImageJ, US National Institutes of Health; http: //imagej.nih. gov / IJ /).

Morfologia cellulare e quantificazione dell’adesione focale

Le cellule sono state seminate a una concentrazione di 5.000 cellule / pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Dopo 24 ore, le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 4% in PBS e colorate con rodamina-falloidina e DAPI (Life Technologies) per evidenziare rispettivamente la rete e i nuclei di actina. Le adesioni focali sono state rilevate in modo specifico da un anticorpo anti-paxillina N-Term 04-581 di Millipore (Merk). Le immagini sono state acquisite con un microscopio Nikon Eclipse Ti-E con obiettivi diversi: Nikon Plan 10X / 0,10; Nikon Plan Fluor 40X / 0,75; e Nikon Plan Apo VC 60X / 1,40 (Nikon Instruments). 19,20 La diffusione delle cellule e la densità di adesione focale sono state quantificate con il software ImageJ.

Analisi Statistiche

I dati sono stati analizzati da GraphPad Prism6 (GraphPad Software). Ogni esperimento è stato ripetuto almeno tre volte. L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il test t di Student. Un valore P di <0,05 è stato considerato significativo.

RISULTATI

La microstruttura di campioni anodizzati e pristine ha rivelato l’assenza di picchi e valli in un contesto di superfici irregolarmente lisce.

Analisi della Composizione Chimica

XPS è stato realizzato per studiare la composizione chimica della superficie per i campioni di Ti anodizzato (AnoTi). La pre-pulizia superficiale dei campioni non è stata eseguita intenzionalmente per non alterare la composizione chimica della superficie che era presente al momento dei test biologici. La Figura 2a mostra l’analisi XPS wide-scan eseguita sul campione AnoTi. I contributi principali erano legati agli elementi Ti, O e C, come previsto. Per verificare la conversione effettiva del Ti iniziale nella sua forma ossidata dopo l’anodizzazione, sono state acquisite analisi HR XPS di entrambi i contributi Ti2p e O1s e gli spettri corrispondenti sono mostrati nelle Figure 2b e 2c, rispettivamente. Due contributi principali sono chiaramente risolti per lo spettro Ti2p, che sono posizionati a 464,5 e 458,8 eV. Entrambi possono essere associati agli ioni Ti4 + appartenenti alla fase TiO2.21 Inoltre, l’assenza del picco generalmente situato intorno a 453,5 eV e rappresentativo della fase Ti metallica può essere evidenziata. Ciò testimonia chiaramente il successo della conversione di Ti nel corrispondente ossido dopo il processo di anodizzazione. Il picco HR O1s mostra un contributo importante a causa degli atomi di ossigeno coinvolti nei legami chimici O-Ti. Quindi, una piccola parte dello spettro può essere ascritta agli atomi di ossigeno coinvolti nei gruppi ossidrile -OH, che possono essere adsorbiti sulla superficie del campione come contaminanti. La loro presenza può essere nuovamente correlata all’evitare intenzionalmente il processo di pre-pulizia della superficie analizzata prima di iniziare l’acquisizione di XPS.

 

Proprietà bagnanti

Le proprietà bagnanti dei campioni di Ti e AnoTi originari sono state valutate mediante misurazioni OCA. I campioni di Ti pristine hanno mostrato un comportamento abbastanza idrofilo, con un valore medio di angolo di contatto (CA) di θ35 gradi e θ40 gradi, rispettivamente per acqua e diiodometano (CH2I2). Dopo il processo di anodizzazione, è stata trovata una transizione verso il regime idrofobico; in effetti, i campioni AnoTi hanno mostrato un valore CA medio di circa 90 gradi per l’acqua e 44 gradi per CH2I2.

L’energia superficiale libera (SFE) insieme alle sue componenti po- li e dispersive è stata calcolata a partire dai valori CA restituiti per le sonde di acqua e di liquido CH2I2, applicando la teoria di Owens-Wendt. I risultati sono riportati nella Tabella 1.

 

 

 

 

 

 

 Adesione cellulare

Per studiare la prima interazione di cheratinociti e fibroblasti dermici con superfici di AnoTi, sono stati eseguiti esperimenti di adesione cellulare. Come mostrato in figura 3, Ti anodizzato ha moltiplicato l’adesione di entrambe le cellule HaCaT e NHDF (Figure 3a e 3b) rispetto al Ti non trattato a 10 minuti.

 

 

 

 

 

 

 

Viabilità Cellulare

Per capire come il trattamento con AnoTi possa influenzare il numero di cellule vitali durante i primi giorni di coltura, la vitalità cellulare delle cellule HaCaT e NHDF è stata valutata a 24, 48 e 72 ore (Fig. 4). Il trattamento con AnoTi ha aumentato significativamente la vitalità cellulare delle cellule HaCaT ad ogni punto temporale considerato, mentre lo stesso effetto era presente solo a 48

e 72 ore sulle cellule di NHDF.

 

Morfologia cellulare e quantificazione dell’adesione focale

Per studiare ulteriormente gli effetti biologici del trattamento con AnoTi su cellule NHDF e HaCaT, è stata presa in considerazione la morfologia cellulare. L’organizzazione del citoscheletro e la distribuzione dell’adesione focale sono mostrate in Fig 5. Come è possibile apprezzare, per le cellule HaCaT (Figure 5a e 5b), non sono state osservate differenze nella morfologia cellulare ed il numero di adesioni focali tra le condizioni considerate. In particolare, le cellule HaCaT apparivano piccole e arrotondate, senza morfologia polarizzata. D’altra parte, le cellule di NHDF seminate sulla superficie di AnoTi (Fig. 5c) hanno mostrato un numero maggiore di aderenze focali e una dimensione minore rispetto ai fibroblasti seminati su Ti non trattato (Fig. 5d).

 

 

 

DISCUSSIONE

L’integrazione dei tessuti molli è importante per raggiungere il successo a lungo termine degli impianti dentali.22 Come possibile mezzo per migliorare la sigillatura della mucosa degli impianti dentali, la risposta precoce dei fibroblasti umani e delle cellule epiteliali coltivate su superfici di titanio anodizzato rosa era l’oggetto di questo studio. La microstruttura delle superfici testate era caratterizzata in modo qualificato mediante microscopia elettronica a scansione ed era irregolarmente liscia per entrambi i tipi di campioni senza differenze morfologiche rilevanti, che è coerente con la formazione di uno strato sottile di ossido. Come indicato in precedenza, il processo di anodizzazione qui utilizzato genera colori di interferenza dovuti alla presenza di uno strato sottile trasparente. Nessuna struttura anticorrosiva si è formata come accade per trattamenti di anodizzazione più aggressivi, in particolare quelli adatti per migliorare l’osteointegrazione.23 Le interazioni tra cellule e substrato sono dettate dall’interfaccia della forma dei materiali nel sistema biologico in cui interagiscono. Per caratterizzare la composizione chimica del trattamento superficiale proposto, XPS è stato scelto come tecnica elettiva, a causa della sua alta sensibilità e della profondità di campionamento limitata. L’indagine XPS eseguita sui campioni AnoTi ha confermato Ti, O e C come gli elementi principali previsti. La presenza effettiva di ossidi di Ti è stata invece documentata attraverso analisi HR XPS di entrambi i contatori di Ti2p e O1s, come descritto. Le misurazioni OCA hanno mostrato che il processo di anodizzazione induceva una transizione verso il regime idrofobico (AnoTi CAH2O a 90 gradi e CACH2I2 44 gradi), poiché il titanio incontaminato era idrofilo (Ti CAH2O 35 gradi e CACH2I2 40 gradi). Di conseguenza, i valori di SFE differivano significativamente tra il campione anodizzato (SFE = 37 mN m) e quello non trattato (SFE = 61.60 mN m). Va sottolineato che la suddetta transizione verso l’idrofobicità è lieve e abbastanza coerente con un corpo di conoscenze ancora in formazione e quindi apparentemente in conflitto.24-26 Molti studi supportano l’idea che le cellule tendono ad attaccarsi in modo più efficiente su superfici idrofiliche che su idrocarburi superfici fobiche, 27-31, mentre altri autori hanno riferito che le cellule aderivano e proliferavano alla massima velocità coltivate su substrati idrofobici.32 La confusione può sorgere a causa della complessa determinazione del comportamento di bagnatura di per sé, che è determinata dalla superficie e dalla pografia numerose caratteristiche fisico-chimiche delle varie interfacce indagate. Inoltre, in particolare, la gamma di bagnabilità della superficie utilizzata in questi studi è ristretta.L’impostazione sperimentale in vitro adottata qui ha seguito i protocolli precedentemente pubblicati.33-38. I risultati più interessanti hanno avuto origine dall’osservazione del comportamento cellulare: il Ti anodizzato ha moltiplicato l’adesione di entrambe le cellule epiteliali (HaCaT) e dei fibroblasti (NHDF) quando rispetto a Mac a 10 minuti. Analogamente, la vitalità di entrambi i tipi cellulari è stata migliorata a 2 e 3 giorni sulle superfici anodizzate. In particolare, questa risposta rigorosamente simile di HaCaT e NHDF non è stata mantenuta in termini di morfologia cellulare e adesione focale. Mentre l’NHDF cresciuto su AnoTi ha aumentato significativamente la densità di adesione focale e si è ridotto se confrontato con il titanio non trattato, questo non è accaduto per HaCaT mantenuto nelle stesse condizioni.I fibroblasti hanno ridotto la loro diffusione cellulare su superfici idrofobiche in accordo con Wei et al.39 I fibroblasti sono il principale costituente cellulare del tessuto connettivo fibroso adiacente agli impianti, che è necessario per ottenere l’impermeabilizzazione dei tessuti molli. è necessaria la sione dei fibroblasti gengivali agli impianti dentali per integrare il dispositivo nella gengiva circostante 41, che a sua volta è dettata dalla risposta iniziale delle cellule alle proprietà superficiali.42,43 Modifiche superficiali specifiche degli impianti in titanio finalizzati a migliorare l’attaccamento e la vitalità dei fibroblasti sono molto recenti.44,45Ci sono stati studi precedenti sul comportamento delle cellule epiteliali, 46 che supportano l’importanza di queste cellule per raggiungere e mantenere la tenuta permeale attorno agli impianti.46-49 Sfortunatamente, l’epitelio perimplantare è ostacolato da pochi attacchi di membrana basale, 50 che sembrano ristretti, se presenti, al terzo apicale e non includono mai il margine gengivale coronale.51 Anche se la membrana basale si affaccia sul lato del tessuto connettivo attorno agli impianti secondo lo studio ultrastrutturale di Fujiseki e colleghi, 51 alcuni rapporti hanno incoraggiato un percorso di ricerca focalizzata sulla modificazione superficiale chimica in grado di favorire gli attacchi di membrana basale.52,53 Una sigillatura epiteliale funzionale perimplantare potrebbe prevenire l’invasione batterica che può portare alla peri-implantite.54,55Sebbene l’anodizzazione rosa sia stata recentemente proposta come opzione estetica per gli abut- tisti di impianti dentali, 12,13 potrebbe essere ancora più utile per ottenere una maggiore adesione dei due principali tipi di cellule all’interno dei tessuti molli perimplantari. Pertanto, anche se sono necessarie ulteriori ricerche sia in vivo che clinicamente, i dati attuali potrebbero ispirare approcci aggiuntivi per preparare le superfici implantari meno inclini all’insorgenza della cosiddetta peri-implantite.

 

CONCLUSIONI

 

A causa dell’impostazione in vitro adottata qui, basata sul confronto tra una condizione clinica standard (superficie lavorata) e una nuova condizione di prova (superficie anodizzata), si può affermare che l’anodizzazione rosa potrebbe migliorare l’adesione dei fibroblasti e cellule epiteliali. Pertanto, questo risultato promettente suggerisce fortemente un possibile uso clinico di superfici rosa anodizzate a contatto con le cellule dei tessuti molli gengivali.

 

RINGRAZIAMENTI

 

Gli autori non hanno riferito di conflitti di interesse relativi a questo studio.

 

The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants 577

 

 

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578 Volume 33, Number 3, 2018

 

 

 

The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants 579

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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